北京儿童医院

微生物研究室
2016-05-10 09:56:42
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简介

儿研所微生物室成立于 1989 年,由杨永弘研究员任主任。 此后,在杨永弘研究员主持下,开展了一系列有关小儿细菌感染性疾病及小儿呼吸道细菌方面的研究。经过十八年的奋斗,开展和完成了国家攻关项目、自然科学基金项目等,研究条件也日渐改善,研究集体亦逐渐壮大。与美国、俄国、芬兰等国家的实验室有合作。从1994年起被卫生部确定为链球菌专业实验室。1999年,成为亚洲地区常见病原耐药检测网(ANSORP)成员。

科研内容

(一)常见细菌研究

1. 流感嗜血杆菌:小儿肺炎是儿童的第一位死因。其病原谱十分复杂。细菌性肺炎可以单独存在,或与其它病原混合感染。病毒性肺炎引起患儿死亡,其中很重要的原因是合并细菌感染。从2004年门诊540例呼吸道感染儿童的鼻咽分泌物中分离出140株(25.9%)肺炎链球菌、119株(22%)流感嗜血杆菌和76株(14.1%)卡他莫拉菌。从2005年门诊309例儿童的鼻咽分泌物中分离出76株(24.6%)肺炎链球菌、62株(20.1%)流感嗜血杆菌、7株(2.3%)金黄色葡萄球菌和2株(0.6%) A组链球菌。从2004年101例住院肺炎儿童鼻咽拭子和痰标本中分离出21株(21%)肺炎链球菌、6株(6%)流感嗜血杆菌、6株(6%)金黄色葡萄球菌和1株(1%)卡他莫拉菌。因此,呼吸道感染儿童鼻咽部携带细菌第一位是肺炎链球菌,第二位是流感嗜血杆菌,其次是卡他莫拉菌、葡萄球菌和A组链球菌。

2. 肺炎链球菌:对临床分离(呼吸道和血中)的肺炎链球菌与流感嗜血杆菌进行分型,了解我国小儿常见血清型是否与疫苗的型一致,可为这2种WHO推荐的疫苗可否在我国应用提供依据。1998年我们与美国CDC合作项目“预防呼吸道感染性疾病死亡-估计疫苗的效果和抗生素的耐药性”的结果显示在所有鼻咽部携带的肺炎链球菌菌株中7价结合疫苗的覆盖率只有三分之一,在青霉素不敏感菌株中覆盖率不到60%。而2005年我们的国家“十五攻关”课题的结果显示在所有菌株中7价结合疫苗的覆盖率已达三分之二,在不敏感菌株中覆盖率高达80%。这提示在全球一体化进程中,世界范围内旅游、经商、考察和留学等加速细菌的克隆传播,尤其是耐药细菌的克隆传播。因此,我们认为可以考虑在我国推广肺炎链球菌疫苗接种,这可大大降低肺炎链球菌感染的疾病负担。这一系列研究尚属国内首例。

3. B组链球菌:孕妇直肠和阴道携带B族链球菌(GBS)是引起新生儿侵袭性GBS感染的主要原因,以前在我国没有得到足够的认识。①GBS血清学分型研究,首次在国内证实北京地区Ia, Ⅱ(Ⅱ/C), Ⅲ(Ⅲ/R) 型是主要血清型。而除Ia, Ⅲ(Ⅲ/R)外,Ib、V、NT型在广州也较常见,该结果为在国内研制优势GBS菌苗进行免疫预防GBS 感染提供了重要的理论依据。②GBS基因型和分子生物学方法的研究,从基因水平证实GBS感染的母婴垂直传播途径的存在,具有非常重要的临床使用价值。首次在国内提出ScpB、ScaA, glnA,IS1381,IS1548,IS861基因可能在GBS感染过程中起着重要作用,是重要的致病毒力因子,从基因水平上寻找出GBS感染的发病规律和流行特点。③发展粘膜免疫的B族链球菌莢膜多糖(GBS CPS)结合物疫苗,诱导机体产生全身(系统)和粘膜局部两方面的免疫力。在GBS莢膜多糖-破伤风类毒素结合物疫苗基础上进行改进,成功地制备了GBS莢膜多糖-基因重组霍乱毒素B亚单位结合物菌苗, 提高了疫苗的粘膜免疫原性。同时,采用粘膜途径给予疫苗,以取代传统的注射免疫方式,使这一GBS莢膜多糖结合物菌苗具有诱导全身和粘膜免疫力的双重作用。目前,该菌苗的研制成功并进行了I期动物实验,尚需II、 III期人群实验一个相当长的时间,我们期待这一菌苗早日应用于易感孕龄妇女,可提高这一人群的系统和粘膜抗GBS感染能力,减少孕妇GBS带菌率和新生儿感染,从而大大减少抗生素的预防性和治疗性应用,带来巨大的社会和经济效益。此研究是国家“九五攻关”项目,为本研究群体培养了许多研究人才,包括3名博士,4名硕士,1名北京市科技新星,并获得科研成果。

4. A组链球菌:2005年7-11月贵州某个地区发生急性肾小球肾炎爆发,我们与中国CDC紧急赶往现场进行流行病学调查并采集咽拭子和血清各370份左右。分离出A组链球菌41株,并检测了血清补体(C3)和抗链球菌素O(ASO),其中高发病学校组的ASO明显高于低发病学校组和无发病学校组。今后我们将对41株A组链球菌进行血清M蛋白分型和emm基因分型,还将进行血清抗DNA酶B等检测。

5. 卡他莫拉菌:在一项422例呼吸道感染儿童鼻咽部卡他莫拉菌携带率调查中发现总携带率为18.7%,5月份携带率最高,达33%。携带率与年龄无关,与入托有关。

6. 金黄色葡萄球菌:为探讨金葡菌分泌的外毒素作为传统变应原在儿童特应性皮炎中的发病机制,从儿童AD皮损局部培养的金葡菌,47.45%可分泌具有超抗原活性的外毒素,并且25.00%分泌两种以上毒素。SEB为最常检测到的外毒素,占36.11%;其次为SEA、TSST-1和SEC,SED最为少见。

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7. 百日咳杆菌:在111份有咳嗽症状患者鼻咽拭子中,8例百日咳杆菌培养阳性,阳性率为7.2%。在111例血清标本的PT-IgG及FHA-IgG,分别有22.5%(25/111)及10.8%(12/111)呈阳性结果,总血清阳性率为25.2%(28/111)。二者相结合阳性率为29.7%(33/111)。研究结果表明①小婴儿因年龄小,未进行或不完全进行免疫接种,年长儿及成人免疫接种后所产生的免疫力随时间而减弱,两者成为百日咳的易感者②百日咳杆菌是导致长期咳嗽疾病的主要病原之一。③鼻咽拭子培养对未免疫小婴儿的百日咳诊断具有较高的价值,而血清学方法有益于年长儿和成人的百日咳诊断④诊断百日咳较好的实验室方法是鼻咽拭子培养与血清学检查相结合。此课题是国家自然科学基金项目,并与芬兰合作完成。

(二)常见感染性疾病的病原学研究

1. 脑膜炎病原学:北京儿童医院住院的210例临床诊断为化脓性脑膜炎研究结果显示Hib脑膜炎占10%,肺炎链球菌9.8%、脑膜炎双球菌34.2%。在我国合肥市进行以人群为基础目前为止是国内最大的一次小儿化脓性脑膜炎三年病原流行病学监测,结果显示临床确诊病例小儿化脑60例,其中31例(51.7%)Hib抗原阳性,仅有3例脑脊液细菌培养Hib阳性,该市Hib脑膜炎年发病率15岁以下4.81/10万,五岁以下小儿的发病率为10.66/10万,病死率为9.7%,存活患儿24.1%留有精神和神经系统并发症和后遗症。此项目获WHO资助。

2. 中耳炎病原学:对56例化脓性中耳炎患儿中耳分泌物进行细菌培养,分离出60株致病菌,其中肺炎链球菌和流感嗜血杆菌各19株(31.7%),A组链球菌10株(16.7%),金黄色葡萄球菌6铢(10%),表皮葡萄球菌3株(5%),大肠埃希菌2株(3.3%),变形杆菌1株(1.6%)。

3. 肺炎病原学:1998年我院与芬兰合作的研究报道(2篇论文发表在Pediatr Infect Dis J, 2001/2002),102例住院肺炎患儿经血培养、鼻咽分泌物抗原、抗原和抗体检测,52%的病例可明确病原学诊断,其中病毒感染为24%、细菌21%(肺炎链球菌12%,流感嗜血杆菌9%),非典型病原如支原体、衣原体感染7%,两种以上病原混合感染占11%。另外,2004年我们随机抽取自1953年至2002年在北京儿童医院临床和尸检均诊断为肺炎的石蜡包埋肺组织标本202例,应用多重PCR、Southern 杂交、D-ISPCR三种方法检测石蜡包埋组织标本中的肺炎链球菌和b型流感嗜血杆菌。结果表明肺炎链球菌和b型流感嗜血杆菌是导致儿童社区获得性肺炎患儿死亡的主要致病细菌,分别为60%和15.3%,混合感染为13%。同时表明直接原位PCR法用于检测小儿肺炎病原,灵敏、特异、可定位。此结果在国内外学术会议上报告后引起与会者极大兴趣。此研究也是国家十五课题一部分。

4. 脓疱病病原学:对246例脓疱病患儿皮损分离出病原菌233株,无菌生长13例,培养阳性率94.7%。其中单纯金黄色葡萄球菌214例,占87.0%;单纯A组链球菌4例,占1.6%;两者混合感染5例,占2%;表皮葡萄球菌10例,占4.1%。从1990年到目前为止,已经保存脓疱病患儿皮损分离出金黄色葡萄球菌1500株,将开展进一步研究。

(三)常见细菌对抗生素耐药性和耐药机理研究

1. 流感嗜血杆菌:了解细菌病原的抗生素耐药情况和耐药机理,可为临床治疗提供依据,提高治疗效果,节省医疗费用,具有巨大的社会效益和经济效益。我们从2000年至2005年连续6年对流感嗜血杆菌进行抗生素耐药监测,这是亚洲常见致病菌耐药监测网的项目,也是国家自然科学基金的项目,同时联合4家儿童医院最先成立国内耐药监测网。这是目前国内耐药监测资料最完整、时间最长、前瞻性的项目,并且还将继续下去。对氨苄青霉素耐药率和β内酰胺酶产酶菌率从2000年10%增长到2004年24%,呈明显逐年上升趋势。同时发现我国2000-2003年北京,上海,广州和西安三年四地小于5岁呼吸道感染儿童鼻咽部携带的氨苄青霉素耐药菌株,全部为TEM-1型β内酰胺酶的产酶菌株。并且通过脉冲电场凝胶电泳分析,有相当一部分耐药菌株存在克隆传播,发现一种基因型耐药菌株(A组)有明显流行传播趋势。此研究与肺炎链球菌研究一起获得两项国家自然科学基金资助。培养了3名博士,3名硕士,正在申报科研成果。

2. 肺炎链球菌:同流感嗜血杆菌抗生素耐药监测一样连续进行6年。肺炎链球菌对青霉素不敏感率由2000年的22%增加到2004年的32.4%,P<0.05。另外,200株肺炎链球菌对红霉素耐药率高达89.5%(179株),大环内酯耐药表型以结构型大环内酯类、林可酰胺类和链阳性菌素B耐药表型(cMLS)为主,占红霉素耐药株的95.9%,诱导型大环内酯类、林可酰胺类和链阳性菌素B耐药表型(iMLS)为1.4%,M型为2.7%。耐药基因特征如下,仅携带ermB基因菌株为79.6%,同时携带ermB和mefA基因菌株为17.7%,仅携带mefA基因菌株为2.7%,未发现ermB或mefA基因检测均为阴性的菌株。

3. B组链球菌:对193株细菌进行抗生素耐药性和红霉素耐药基因检测,结果显示虽然对青霉素类和头孢菌素类敏感,但中介率达17%,红霉素耐药率由1998年的8%上升至1999年的16%。在我国ermB基因在B组链球菌耐药机制中起主要作用。

4. A组链球菌:1994年对114株临床分离株进行抗生素MIC测定,发现对青霉素类和头孢菌素类敏感,对红霉素耐药率为66.5%。

5. 卡他莫拉菌:对儿童携带的214卡他莫拉菌分离株产酶率和9种抗生素敏感性测定和对β内酰胺酶产酶株耐药基因特征进行研究,结果显示北京地区携带的卡他莫拉菌β内酰胺酶产酶率较高(94.4%),产酶株对氨苄青霉素耐药较为严重,β内酰胺酶产酶株以携带Bro-Ⅰ基因为主,β-Ⅰ基因携带株耐药性较Bro-Ⅱ基因携带株明显高。

6. 金黄色葡萄球菌:用琼脂稀释法检测了471株从北京地区收集的金黄色葡萄球菌对11种抗菌药的敏感水平,其中422例从脓疱疮(社区感染)患儿分离得到,49株从烧伤病房住院(院内感染)患者分离得到。结果为422例脓疱疮患儿分离株对苯唑青霉素的耐药率由1993年的12.2%升至2000年的29.8%,且均表现为低度耐药,MIC值在16μg/ml以下。所有菌株对青霉素的耐药率为100%。49株院内感染菌株对苯唑青霉素耐药率为63.3%,其中29株表现为高度耐药,MIC值在256μg/ml以上。全部耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)都是多重耐药菌株。对49株院内感染菌株和99株经药敏试验测定为MRSA社区感染菌株用PCR方法进行了mecA耐药基因和nuc基因的检测。结果显示,148株菌株nuc基因均呈阳性,进一步证实为金黄色葡萄球菌;29株高度耐药的院内感染MRSA菌株mecA耐药基因阳性,101株低度耐药的MRSA菌株和18株MSSA 菌株mecA耐药基因均阴性。

7. 结核杆菌:开展了121株结核分枝杆菌菌种鉴定和药敏试验,其中对利福平和异烟肼均耐药56株,利福平敏感而异烟肼耐药10株,利福平耐药而异烟肼敏感15株,利福平和异烟肼均敏感40株。结核分枝杆菌(TB)的spoligotyping(间隔区寡核苷酸分型法)和IS6110-RFLP(插入序列6110限制性片段长度多态性分析)基因分型研究,并完成了结核分枝杆菌耐利福平(RFP)和异烟肼(INH)常见突变位点检测的研究。这也是国家自然科学基金的项目。

(四)儿科常用抗生素合理使用

我国滥用抗生素的的情况非常严重。早在90年代初的一项研究中,我们发现门诊病人中98%医生使用了抗生素,其中1/3就诊前已经使用,并且证明了标本中存在的抗生素对细菌培养结果有明显影响(Pediatr Infect Dis J 1993),可以解释国内小儿化脑CSF培养阳性率不足20%,小儿肺炎血培养几乎全是阴性结果。并且,这也是导致细菌对抗生素耐药问题日趋严重的主要原因。因此我们申报国家“十五攻关”课题,对5家儿童医院抗生素使用进行回顾性(2000.1 -2004.12)研究,结果汇总分析表明①各医院总收入、医疗、药品、西药、抗生素及注射用抗生素都逐年增加;②青霉素及广谱青霉素类、大环内脂类、头孢菌素类、二酶抑制剂复合制剂类所占比例最高,而且每年用药排序略有不同;③五家医院三年来抗生素使用强度不同以上海和重庆儿童医院抗生素使用强度最大,北京和广州稳定;④在抗生素使用种类方面,以青霉素类最高依次为大环内脂类、三代头孢菌素类、二代头孢菌素类、酶抑制剂复合制剂类、一代头孢菌素类,随着时间推移,其中大环内脂类、酶抑制剂复合制剂类和三代头孢菌素类用药强度在逐年上升,可以看出儿科临床用药品种、档次、价格越来越高,应引起我们高度重视;⑤各医院对各种抗生素使用频度谱明显不同,我国北方地区的代表北京儿童医院数据显示儿科常用药以大环内脂类用药频度最高,南方地区上海儿童医院、重庆儿童医院使用青霉素类黄胺类药物频度较多,重庆地区虽然抗生素使用频度逐年下降,但高级别的酶抑制剂复合制剂类使用频度有所增加;⑥五所医院相比较,上海儿童医院和重庆儿童医院注射用抗生素的用药频度较高。同时,我们还与澳大利亚有关部门联合举办了两届抗生素合理使用专家研讨会,取得了极大的成功。

科研环境

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通过十余年的努力,如今微生物免疫室的实验条件已经有很大改善。细菌培养、药敏检测、保存,细菌DNA提取、基因扩增,细菌染色体限制性多态性分析等都可以在室内完成。

研究生培养情况

已培养 30-40 名硕士和博士。 目前,在实验室进行研究的研究生硕士4名,博士2名。

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